正相、反相和極性膠聯(lián)柱使用手冊(cè)
注意
此色譜柱填充的是改性硅膠材料。向柱內(nèi)導(dǎo)入堿性溶劑（pH>7.0）或酸性溶劑（pH<2.0）會(huì)導(dǎo)致柱子損壞。在使用這個(gè)柱子之前，你要充分地熟悉這本手冊(cè)講述的內(nèi)容。未正確地使用不能享受保修待遇。
簡介
此柱填充的是反相或者極性膠聯(lián)型態(tài)的硅膠基質(zhì)材料的硅膠。硅膠形態(tài)的柱子用于正相（非水）條件。
反相（C8，C18，ODS，RP-8和RP-18）通常用于反相條件（水相）。
極性膠聯(lián)型（APS，diol，CN和NH2）依照應(yīng)用目的，可以用于正相和反相條件。建議不要將一個(gè)相同的柱子用于差別非常大的條件下，這是因?yàn)橹釉谔囟ǖ臈l件下，固定相的性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，所以在其他的條件下，會(huì)影響柱效。也不建議將硅膠柱用在反相條件下或者將反相柱用在正相條件下，這是因?yàn)檫@種過程會(huì)發(fā)生重復(fù)性差的問題（每一次注射之間和柱與柱之間的比較）。
色譜柱老化
在開始分析工作以前，柱子必須經(jīng)過正確的老化。一個(gè)沒有正確老化的柱子可能會(huì)帶來問題，諸如很差的柱效或者分離情況發(fā)生變化等等。
A．在反相條件下老化
要老化這類柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你選用的洗脫液進(jìn)行平衡。在發(fā)貨以前，每根柱子都已經(jīng)測(cè)試過并進(jìn)行了老化。因此沒有必要在*次使用時(shí)用水沖洗）。如果流動(dòng)相中使用了添加物（例如緩沖液或離子對(duì)試劑），建議使用正確比例的但不含此添加物的流動(dòng)相進(jìn)行緩沖沖洗。緩沖沖洗應(yīng)當(dāng)首先以低流速進(jìn)行，zui后再使用正常流速。
B．在正相條件下老化
柱效可能會(huì)受水與固定相的鍵合的嚴(yán)重影響。柱子的干燥（激活）或潤濕（失活）可能是需要的。使用的溶劑可能是水飽和的或者是無水的。干燥柱子可以使用無水的二氯甲烷。
C．對(duì)于極性鍵合柱的特殊說明
由于這些柱子可以用于反相或者正相條件，在進(jìn)行老化以前，一定要首先檢查你要使用的淋洗溶劑或洗脫液是否可以與封裝在柱子里的溶劑相混溶。如果這些溶劑不能混溶，必須先使用一個(gè)合適的緩沖溶劑進(jìn)行沖洗。
洗脫液
注意第1節(jié)和第2節(jié)。一定不要使用pH低于2或者高于7的緩沖液，這是由于它們會(huì)改變固定相的性質(zhì)。極性鍵合柱使用在3到5 之間。在使用以前，洗脫液要進(jìn)行脫氣，以及使用0.5微米的濾膜過濾，以免發(fā)生檢測(cè)和泵送問題。
一定要在開始使用系統(tǒng)以前檢查水溶液中有否微生物生長，否則你的柱子會(huì)堵塞，柱壓會(huì)升高到無法接受的水平。

流量和壓力
柱內(nèi)徑（毫米）        流速        （ml/min）        
                  *        zui高        
2.0                0.2        1.0        
3.0              0.4        2.0        
4.6              1.0        4.0        
10.0            4.7        18.0        
注意：zui高壓力：不銹鋼柱：4500psi；玻璃柱：3000psi
增加流速或者降低流速要采取小的間隔變化以防止填充床的擾動(dòng)。
如果你想更換柱子，要降低流量至0，等待洗脫液*流出柱子為止（2分鐘）。
拆除柱子而沒有等待壓力的降低會(huì)損壞柱子。
高柱壓的產(chǎn)生一般是由于不正確地使用柱子的結(jié)果。
使用保護(hù)柱（見第6節(jié)）會(huì)防止污染物沉積在分析柱上。
樣品準(zhǔn)備
保持柱子長壽的關(guān)鍵是進(jìn)樣前適當(dāng)?shù)牡臉悠诽幚怼Ｄ惚仨毞乐箤⑹杷?與流動(dòng)相極性差別很大的化合物泵入色譜柱，不管是來自流動(dòng)相還是樣品。特別地，要禁止導(dǎo)入顆粒雜質(zhì)。這些zui終都會(huì)造成操作壓力的增高而且非常困難或者不可能去除。
保護(hù)柱
一定要使用保護(hù)柱，因?yàn)闃悠泛拖疵撘何廴究赡軙?huì)造成柱壓力的增高而且影響選擇性。對(duì)于ChromSep 柱我們建議使用正確型號(hào)的ChromSep 保護(hù)柱。這個(gè)柱子的填充材料與用于分析的色譜柱的材料相似。當(dāng)柱壓增高的或者觀察到柱效降低的時(shí)候就需要更換保護(hù)柱了。對(duì)于常用不銹鋼柱，我們建議使用相同型號(hào)的Chromguard High Efficiency（）柱（10X3.0mm） 或High Capacity（高容量）柱（50X3.0mm）。
進(jìn)樣量和濃度
柱子的zui大載樣量取決于：柱子的型號(hào)，使用的條件和樣品的類型。很難給出一個(gè)一般的指示。對(duì)于進(jìn)樣體積的建議則比較容易（見表中的典型值）。
注射了太大體積或太濃的樣品會(huì)使峰展寬或者峰融合。
柱尺寸（長度*內(nèi)徑）        zui大樣品體積        
250×2.0mm              ±10μl        
200×3.0mm              ±15μl        
250×4.6mm              ±50μl        
250×10.0mm            ±250μl        
溫度HPLC柱在柱溫箱中使用。重復(fù)性取決于溫度控制。*的溫度與特定的應(yīng)用有關(guān)。溫度影響洗脫液流動(dòng)的線速度。在使用ChromSep玻璃柱的時(shí)候，一定要調(diào)節(jié)流速使壓力保持在3000psi以下。
貯存
一定不要在柱子內(nèi)充滿緩沖液或者其他含鹽類的洗脫液的情況下貯存色譜柱。 貯存溶劑應(yīng)當(dāng)含有至少20%的有機(jī)溶劑，以防止有細(xì)菌的生長。
柱效損失的可能原因
額外的峰展寬。當(dāng)使用小直徑或者長度較短的柱子時(shí)，峰展寬的情況可能比較明顯。要保證管路的長度和內(nèi)徑都保持zui小。檢查進(jìn)樣體積和檢測(cè)器檢查池體積是否適用于柱體積。
洗脫的平衡時(shí)間不夠。
不正確柱溫。
不正確的修正濃度。
床壓縮。使用了過大的洗脫流速。將柱子反向，使用低流速。
柱效喪失和/或高背壓
顆粒物積聚在燒結(jié)物或者樹脂床上（它們都會(huì)使背壓增高）。如果柱壓增高了，將柱子與進(jìn)樣器斷開，運(yùn)行泵，以驗(yàn)證背壓的來源確實(shí)是來自柱子的顆粒污染（樣品、洗脫液和系統(tǒng)）。倒轉(zhuǎn)柱子，以反向的流動(dòng)來沖洗柱子。如果這樣不能解決問題，更換進(jìn)口過濾器或者篩板。
微生物在洗脫液中生長。倒轉(zhuǎn)柱子，嘗試以反向的流動(dòng)來將污染物沖洗出柱子。更換進(jìn)口過濾器或者篩板。
有蛋白質(zhì)脂肪，油脂污染或者極性化合物等污染。再生柱子（見第12節(jié)）。
再生
再生反相色譜柱
首先倒轉(zhuǎn)柱子。以大約*流速的40%的流速?zèng)_洗柱子大約45-60分鐘，使用的溶劑的順序要按照水—甲醇—異丙醇—二氯甲烷—異丙醇—甲醇—水進(jìn)行。柱子轉(zhuǎn)回正常方向，使用分析所用洗脫液平衡。注意：在使用另外的淋洗方法的時(shí)候，一定要先用水開始沖洗以去除緩沖液，保證其后的洗脫液可以混溶。
再生硅膠柱
首先倒轉(zhuǎn)柱子。以大約*流速的40%的流速?zèng)_洗柱子大約45-60分鐘，使用的溶劑的順序要按照異辛烷（或己烷）—乙酸乙酯—干燥的異辛烷（或己烷）進(jìn)行。柱子轉(zhuǎn)回正常方向，使用分析所用洗脫液平衡。
再生極性鍵合柱
取決于使用的條件，可以使用反相的條件，也可以使用硅膠柱的條件。
注意：不要使用酮類或醛類沖洗氨基柱，因?yàn)榭赡芘c固定相發(fā)生反應(yīng)。四氫呋喃作為替代可以使用。